应用案例

通过动态光散射分析培养基中的病毒颗粒

发表时间：2025-06-06

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介绍

传统的视觉方法观察溶液中病毒颗粒只能获取极小样本量的瞬时图像，而基于动态光散射的颗粒分析技术则能获得溶液中颗粒粒径的整体平均值。目前，如何准确获得实验室培养病毒的颗粒粒径数据是一项不小的挑战，因为他们必须在含有白蛋白和其他小分子蛋白（如胎牛血清FBS或最低必需培养基MEM中的成分）的细胞培养基中增殖。当病毒颗粒从细胞中释放出来时，体积较大的细胞碎片可通过离心分离，但培养基中的小分子蛋白质无法被去除。通过精确选择动态光散射实验的分布参数，即使在含有培养基中较小蛋白质的背景下，仍能准确分析出病毒颗粒的粒径分布。

背景

鱼类病毒

许多鱼类病毒有可能对观赏和经济类鱼类种群造成重大的经济损失。本文将重点研究以下四种病毒类型，并附上各病毒科的典型结构示意图：

1、CTV（割喉鳟病毒，一种新发病毒）

属于海佩病毒科（Hepeviridae），为直径25-35纳米的小型球形病毒。（图1）

2、IHNV（传染性造血器官坏死病毒）

属于弹状病毒科（Rhabdoviridae），呈子弹形结构，尺寸约为宽70纳米、长170纳米，主要感染虹鳟鱼和红鲑鱼。（图2）

3、ISAV（传染性鲑鱼贫血病毒）

属于正黏液病毒科（Orthomyxoviridae），病毒粒子直径通常为50-120纳米。该病毒多发于养殖的大西洋鲑鱼群体中，致死率极高（图3）。

4、LMBV（大口黑鲈病毒）

属于虹彩病毒科（Iridoviridae），呈二十面体结构，直径约150纳米。目前主要分布于美国东南部的大口黑鲈种群中。（图4）

图1 图2 图3 图4

我们希望在已知培养条件下快速检测溶液中病毒颗粒的存在，并选择动态光散射（DLS）来进行探索。

动态光散射仪器：

实验方法

1、实验样品由美国华盛顿州西雅图市美国地质调查局西部渔业研究中心（USGS Western Fisheries Research Center）友情提供。病毒颗粒在含有胎牛血清（FBS）的最低必需培养基（Minimum Essential Medium）中通过奇努克鲑鱼胚胎细胞培养增殖，并释放至培养基中。通过离心分离去除细胞及细胞碎片后，含有病毒颗粒的培养基保存于5°C冷藏环境中备用。

2、动态光散射（DLS）测量使用布鲁克海文仪器公司（Brookhaven Instruments）的ZetaPALS型号仪器，该仪器配置了BI-MAS粒度测量附件。

3、实验前，样品在25°C的样品舱中平衡至少5分钟，随后在聚苯乙烯比色皿中于25°C条件下进行测量。

4、DLS自相关数据通过NNLS反卷积算法处理，粒径分布结果分别基于光强和数量分布进行统计，最终数据导出为Excel格式，并利用Origin 8.0软件绘图。

数据分析

分布曲线

非负最小二乘（NNLS）分布的统计权重可基于颗粒数量、表面积、体积或实测散射光强进行设定。其中，光强加权法会显著放大溶液中大粒径颗粒的权重，这是由于散射光强与粒径呈幂次关系，如图5所示；而数量加权法则更突出小粒径颗粒的分布特征。

图5

图6

图7

结果与讨论

通过光强加权分布分析，结果明确显示存在符合预期平均尺寸的病毒颗粒，图6所示；但在数量分布中却未检测到这些颗粒，图7所示。这表明病毒颗粒确实存在，但其数量相对培养基中的蛋白质及其他小分子显著稀少。此外，数据中还存在其他大粒径颗粒信号，可能来源于未被完全去除的细胞碎片或表达分子（如RNA、蛋白质）。这些物质因与病毒颗粒尺寸相近，可能在离心步骤中未被有效分离。通过设置合理的对照样本，可进一步区分病毒颗粒与游离细胞碎片。